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测定意义：
CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。
测定原理：
CS 催化乙酰 CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶 A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的 DTNB 转变成黄色 TNB，在 412nm 处有特征吸光值。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无
水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制：
试剂一：液体 10mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 2mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 0.2mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 10mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 支，4℃保存，临用前加入320μL无水乙醇，用不完的试剂4℃保存一周；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入320μL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；
试剂七：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入320μL蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器
或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS（此步可选做）。
⑤ 在步骤④中的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％
或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CS 测定。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。
2、将试剂四、五、六和七在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。
3、样本测定
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试剂名称（μL） |
测定管 |
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试剂四 |
780 |
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试剂五 |
30 |
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试剂六 |
30 |
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样本 |
30 |
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试剂七 |
30 |
将上述试剂按顺序加入 1 mL 玻璃比色皿中，加试剂七的同时开始计时，在 412nm 波长下记
录 20 秒时的初始吸光度 A1 和反应 2min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。