可见分光光度法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
血清铁是指血液中转铁蛋白所结合的铁,该指标常用于鉴别缺铁性与非缺铁性。
测定原理:
亚硫酸钠还原血清Fe3+生成Fe2+,Fe2+进一步与2, 2’-联吡啶显色,在520nm处有吸收峰,测定该波长光吸收值即可计算血清铁含量。
自备仪器和用品:
可见分光光度计、离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、 冰醋酸、氯仿和蒸馏水。
试剂组成和配置:
试剂一:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前配制,加入20mL蒸馏水充分溶解。
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前配制,加入625μL冰醋酸,加入20mL蒸馏水充分溶解。
标准液:液体×1 支(EP 管),10μmol/L Fe3+标准液,4℃保存。
测定:
1. 分光光度计预热30min,调节波长到520nm,蒸馏水调零。
2. 标准液解冻:提前取出标准液,置于室温下充分解冻后混匀。
3. 空白管:取EP管,依次加入400μL蒸馏水,400μL试剂一,400μL试剂二,混匀后盖紧,置于沸水浴5min,自来水冷却。加入200μL氯仿(自备),充分震荡混匀;室温 10000rpm,
离心10min,小心吸取上层液700μL,加入1mL玻璃比色皿,于520nm测定吸光度,记为A空白管。
4. 标准管:取EP管,依次加入400μL标准液,400μL试剂一,400μL试剂二,混匀后盖紧,置于沸水浴5min,自来水冷却。加入200μL氯仿,充分震荡混匀;室温10000rpm,离心10min,小心吸取 上层液700μL,加入1mL玻璃比色皿,于520nm 测定吸光度,记为A标准管。
5. 测定管:取EP管,依次加入400μL血清,400μL试剂一,400μL试剂二,混匀后盖紧,置于沸水浴5min,自来水冷却。加入200μL氯仿,充分震荡混匀;室温10000rpm,离心10min,小心吸取上层液700μL,加入1mL玻璃比色皿,于520nm测定吸光度,记为A测定管。
注意:空白管和标准管只需测定一次。