电位滴定法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
果胶酯酶属果胶酶系,催化水解果胶中甲氧基生成果胶酸,从而增加果胶在水中的溶解度,广泛存在于高等植物和可以降解细胞壁的细菌和真菌中,起内源调控植物细胞壁上及细胞之间果胶含量的作用,在食品工业中具有及其重要的作用和开发前景。
测定原理
果胶酯酶催化水解果胶分子释放H +,是反应体系的的pH下降,用碱液保持体系的pH始终保持在7,通过碱消耗的量反映果胶酯酶的活性。
需自备的仪器和用品
天平、研钵、常温离心机、自动电位滴定仪。
试剂的组成和配制
提取液:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前每瓶加双蒸水100mL 充分溶解。
试剂一:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加少量蒸馏水于50℃加热溶解,冷却后转入1L容量瓶,用蒸馏水定容。
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加少量蒸馏水溶解,转入1L容量瓶,用蒸馏水定容。
样品处理
将组织样品捣碎,按照样品质量(g)和提取液体积(mL)为1: 10的比列(建议取约0.5g样品,加入5mL提取液)冰浴研磨,再于8000g、4℃离心15min,取上清液待测。
测定操作
1. 试剂一于50℃保温 10min,同时打开电位滴定仪,用蒸馏水清洗仪器。
2. 用试剂二补液,补液结束后用取50mL试剂一,用试剂二滴定到pH为7。
3. 加入待测样品5mL,将滴定延迟时间设为180s,用试剂二滴定至pH为7。
4. 滴定结束后记录消耗的试剂二体积 V(mL)和滴定至终点所需时间 T(S)。
计算公式
酶活定义:每g组织每秒钟消耗 NaOH 的量定义为一个酶活单位。
PE 活性(U/g)= V/(T-180)×F/W
V:滴定所消耗的 NaOH 的量,mL;T-180:反应时间,S;F:样品稀释倍数;W:样品质量,g
注意事项
1. 补液结束后检查输液管中是否有气泡,有气泡要补液清除气泡后再进行样品滴定。
2. 实验前先做预实验,如果酶活力太高,滴定超过5min不能达到滴定终点,则需要将样品稀释2-5倍进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。