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活性测定试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。
测定原理：
AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，释放的CoA还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412nm吸光度增加速率可计算AAT活性。
自备仪器和用品：
研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：
试剂一：液体 100 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 15 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 管，-20℃保存。临用前加蒸馏水 1mL 充分溶解，4℃保存。
试剂四：液体 2 mL×1 管，4℃保存。
试剂五：粉剂×1 管，4℃避光保存。临用前加入试剂二 1mL 充分溶解，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心20min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 12000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。
3. 液体：直接检测。
AAT 测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到412nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二在37℃水浴保温30min以上。
3. 空白管：依次在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 20µL 蒸馏水、140µL 预热的试剂二、10µL 试剂三、20µL 试剂四和 10µL 试剂五，迅速混匀后于 412nm 比色，记录 10 s 和 130 s 的吸光值，分别记为 A1 和 A2。△A 空=A2-A1。空白管只需做 1 个。
4. 测定管：依次在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 20µL 上清液、140µL 预热的试剂二、10µL 试剂三、20µL 试剂四和 10µL 试剂五，迅速混匀后于 412nm 比色，记录 10 s 和 130 s 的吸光值，分别记为A3 和 A4。△A 测=A4-A3。如果△A 测偏低，可以延长反应时间，如测定 10 s 和 310 s 的吸光度，相应修改计算公式中反应时间。