上海酶科生物科技有限公司

微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

FC是构成细胞膜的主要成分，也是合成肾上腺皮质激素、性激素、胆汁酸及维生素D等生理活性物质的重要原料。FC浓度可作为脂代谢的指标。

测定原理：

FC氧化酶催化FC生成△4-胆甾烯酮和H₂O₂，过氧化物酶催化H₂O₂、4-氨基安替比林和酚生成红色醌类化合物，在500nm有吸收峰，其颜色深浅与FC含量成正比。

自备仪器和用品：

水浴锅、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：异丙醇 100mL（自备）；

工作液：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

标准品：液体 1mL×1 支，浓度为 5 μ mol/mL，4℃保存。

FC  的提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声2秒，间隔3秒，总时间3min）；然后 8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3．血清（浆）样品：直接测定。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到500nm，蒸馏水调零。

2. FC工作液在40℃水浴中预热 30min。

3. 标准管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入4μL FC标准液和196μL FC工作液，5min

后于500nm测定A标准管。

4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入4μL FC待测液和 196μL FC 工作液，5min后于500nm测定A测定管。