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分光光度法
产品内容：
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
试剂四：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL 蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。
试剂五：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入25mL 蒸馏水，溶解后4℃可保存一周。
试剂六：液体 25mL×1 瓶，室温保存。
试剂七：10μmol/mL 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。
产品说明：
ACC在生物体内催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
ACC 能够催化乙酰辅酶A、NaHCO3 和ATP 生成丙二酰辅酶A、ATP 和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定ACC 活性。
需自备的仪器和用品：
分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本的前处理
1、 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计预热30min 以上，调节波长至660nm，蒸馏水调零。
2、 酶促反应试剂的配制和预热：在试剂二瓶中加入6.5mL 试剂一，充分溶解混匀；在试剂三瓶中加入5mL 蒸馏水，充分溶解混匀；将试剂一、二、三在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10 分钟。
3、 定磷试剂的配制：按H2O: 试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。
注意：配试剂用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
4、0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂七20倍稀释，即取0.5mL试剂七加9.5 蒸馏水，充分混匀。
5、酶促反应
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试剂名称（μL） |
对照管 |
测定管 |
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试剂一 |
450 |
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试剂二 |
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250 |
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试剂三 |
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200 |
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样本 |
50 |
50 |
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确反应30min 后，90℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失），冷却后，10000g 常温离心5min，取上清
6、定磷
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标准管 |
空白管 |
对照管 |
测定管 |
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0.5μmol/mL 标准磷应用液 |
100 |
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蒸馏水 |
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100 |
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上清液 |
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100 |
100 |
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定磷试剂 |
900 |
900 |
900 |
900 |
混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴30min，冷却至室温，在660nm处，蒸馏水调零，记录各管吸光值A。标准管、空白管只要做一次即可，每个测定管需要设一个对照管。
注意：若测定管吸光值大于2，将样品用提取液稀释适当倍数后再进行测定，使吸光值小于2，可提高检测灵敏度，计算公式中乘以相应稀释倍数。