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可见分光光度法
产品内容：
提取液：液体50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体55mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：液体8mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加3mL无水乙醇醇充分溶解。
试剂四：液体35mL×1 瓶，4℃避光保存。
标准品：液体1mL×1 支，4℃避光保存。
产品说明：
磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与胞脂质代谢、信号转导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。
磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器：
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅，无水乙醇。
操作步骤：
一、酶液提取
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5-10 的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g 离心5min，取全部上清于4℃，100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL 试剂一。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500-1000：1 的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞，功率300w，超声3 s，间隔7 s，总时间3min）；然后于4℃，10000g 离心5min，取全部上清于4℃、100000g 离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL 试剂一。
3. 血清：直接测定。
二、测定操作
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空白管 |
标准管 |
测定管 |
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试剂一（mL） |
0.1 |
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试剂二（mL） |
0.15 |
0.15 |
0.15 |
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标准品（mL） |
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0.1 |
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样品（mL） |
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0.1 |
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试剂三（mL） |
0.05 |
0.05 |
0.05 |
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充分混匀，30℃反应30min，沸水浴10min，打开盖子，自然冷却 5mi。 |
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试剂四（mL） |
0.7 |
0.7 |
0.7 |
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30℃反应30min，于1mL 玻璃比色皿，空白管调零，测定500nm 处吸光值，分别记为A 标准管和A 测定管。 |
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