可见分光光度法
注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
脂蛋白酯酶是脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞及巨噬细胞等实质细胞合成的一种酶,可催化甘油三脂水解为脂肪酸和单酯,以供组织氧化供能和贮存,并在不同的组织表现出不同的生理意义。
测定原理
脂蛋白酯酶水解 4-硝基苯棕榈酸酯产生 4-硝基苯酚,在400nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、冷冻离心机、研钵、水浴锅、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿。
试剂组成和配制
试剂一:液体 60mL×1瓶,4℃保存。
试剂二:液体 10mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂三:液体 25mL×1瓶,4℃保存。
样品处理
1. 组织:按照质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约0.1g,加1mL试剂一)加入试剂一,冰浴匀浆后于 4℃,10000g离心 10min,取上清待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一)加入试剂一,冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后于4℃,10000g离心 10min,取上清待测。
3. 血清:直接测定。
测定操作
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对照管 |
测定管 |
样品(μL) |
100 |
100 |
试剂一(μL) |
400 |
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试剂二(μL) |
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400 |
混匀,45℃水浴 10min |
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试剂三(μL) |
500 |
500 |
充分混匀,25℃静置2min,于1mL玻璃比色皿,蒸馏水调零,测定400nm处吸光值,记为A对照管和A测定管,△A=A测定管- A对照管 |