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紫外分光光度法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产AT的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。
测定原理
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和 NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水
试剂的组成和配制
提取液：60mL×1瓶，4℃保存;
试剂一：液体 45mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存一周；
试剂四：液体×1支，4℃保存；临用前加入900μL蒸馏充分溶解备用；用不完的试剂 4℃保存一周；
样本的前处理
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2、工作液的配制：临用前将试剂二转移至试剂一中，充分溶解待用；现配现用；
3、将工作液、试剂三和试剂四37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟。
4、加样表：
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试剂名称(μL) |
测定管 |
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工作液 |
900 |
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试剂三 |
30 |
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试剂四 |
15 |
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样本 |
30 |
将上述试剂按顺序加入1mL石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1和2分20秒时的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。