( Fructose-1,6 Diphosphate ,FDP)试剂盒说明书
可见分光光度法
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
果糖 1,6-二磷酸是机体内的高能代谢物和代谢调控剂,是糖酵解途径的重要中间体,广泛存在于动植物和微生物体内,能影响细胞内钾离子的浓度,改善葡萄糖和其他能量底物的代谢,促进组织氧的释放,广泛应用于临床医药制剂。
测定原理
醛缩酶催化果糖 1,6-二磷酸降解,产物与DNPH缩合成紫红色物质,在540nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、低温离心机、研钵、恒温水浴锅、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿。
试剂组成和配制
试剂一:液体 60mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 1mL×1 支,4℃避光保存。
试剂三:液体 10mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂四:液体 40mL×1 瓶,4℃保存。
样品处理
1. 组织:按照质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约0.1g,加入1mL试剂一)加入试剂一,冰浴匀浆后于 4℃,10000g 离心 10min,取上清待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后 4℃,10000g 离心 10min,取上清待测。
3. 液体:直接检测。
测定操作
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对照管 |
测定管 |
样品(μL) |
100 |
100 |
试剂一(μL) |
220 |
200 |
试剂二(μL) |
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20 |
充分混匀,37℃反应 30min |
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试剂三(μL) |
200 |
200 |
充分混匀,37℃温育 10min |
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试剂四(μL) |
800 |
800 |
充分混匀,于37℃温育10min,于1mL玻璃比色皿,蒸馏水调零,测定540nm处吸光值,记为A对照管和A测定管,△A=A测定管- A对照管 |