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紫外分光光度法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。
测定原理
α-KGDH 催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340 nm 有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH 活性。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一：50mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：10mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：1mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 55.5mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 支，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，4℃保存；
试剂七：粉剂×1 支，4℃保存;
试剂八：粉剂×1 支，4℃保存;
试剂九：粉剂×1 支，-20℃保存;
试剂十：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 2.1mL 蒸馏水充分混匀待用，现配现用。
工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七、试剂八和试剂九转移到试剂四中混合溶解待用；用不完的试剂 4℃保存一周。
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆600g，4℃离心 5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 α-KGDH（此步可选做）。
5、在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体α-KGDH 活性测定。
测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm 处，蒸馏水调零。
2、工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。
3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 40μL 试剂十、60μL 样本和 1.1mL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 的吸光值 A1 和 2min20s 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。