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分光光度法
正式测定前务必取2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
产品内容：
试剂一：液体50mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体10mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体1mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体50mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×2 支，4℃保存，临用前加入800μL 无水乙醇，用不完的试剂4℃保存一周；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入1600μL 蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；
试剂七：粉剂×2 支，-20℃保存，临用前加入800μL 蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；
产品说明：
CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。CS 催化乙酰CoA 和草酰乙酸产生柠檬酰辅酶A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使无色的DTNB 转变成黄色的TNB，在 412nm 处有特征吸光值。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
操作步骤：
一、 样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
（1） 称取约0.1g 组织或收集500万细胞，加入1mL 试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
（2） 将匀浆600g，4℃离心5min。
（3） 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
（4） 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的CS（此步可选做）。
（5） 在步骤（4）中的沉淀中加入200uL 试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3 秒，间隔10 秒，重复30 次），用于线粒体CS 测定。
二、 测定步骤：
1、 分光光度计预热30min 以上，调节波长至412nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂四、五、六和七在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。
3、 样本测定
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试剂名称（μL） |
测定管 |
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试剂四 |
780 |
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试剂五 |
30 |
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试剂六 |
30 |
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样本 |
30 |
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试剂七 |
30 |
将上述试剂按顺序加入1 mL 玻璃比色皿中，加试剂七的同时开始计时，在412nm 波长下记录20 秒时的初始吸光度A1 和反应2min 后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。