微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
哺乳动物 CarE,也称脂族酯酶(aliesterase),广泛分布于组织和器官,属于丝氨酸水解酶家族。CarE 催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解,但不能催化水解乙酰胆碱及其类似物。CarE 参与脂质运输和代谢,并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的和代谢有关,磷农药可结合并且抑制 CarE 活性。
测定原理:
CarE能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯,固篮显色;在450nm光吸收增加速率,计算CarE活性。
自备仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。
试剂组成和配置:
试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体×1 瓶(棕色),4℃避光保存(收货后一周内完成测定)。
粗酶液提取:
1、细菌、细胞样品制备
收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每200万细菌或细胞加入400μL试剂一,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);12000g 4℃离心30min,取上清液待测。
2、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆;12000g 4℃离心 30min,取上清液待测。
3、液体:直接测定
测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到450nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。
3. 空白管:取微量玻璃比色皿/96孔板,依次加入5μL蒸馏水和200μL试剂二,迅速混匀,
于450nm处测定3min内吸光值变化,第10s吸光值记为A1,第190s吸光值记为A2。△A空白管=A2-A1
4. 测定管:取微量玻璃比色皿/96 孔板,依次加入5μL上清液和200μL试剂二,迅速混匀,于450nm处测定3min内吸光值变化,第10s吸光值记为A3,第190s吸光值记为A4。△A测定管=A4-A3
注意:空白管只需测定一次。