点击图片查看原图
分光光度法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。
测定原理
NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3 -+ NADH + H＋ → NO2- + NAD＋ + H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm 有吸收峰，可用分光光度法测定。
需自备的仪器和用品
可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
诱导剂储备液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 10mL×1 瓶，-20℃保存。
试剂二：液体 4mL×1 瓶，-20℃保存。
试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃保存，（如出现结晶析出，60度水浴溶解后使用）；
试剂四：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。
试剂五：标准储备液 1mL，-20℃保存。
诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。
0.1μmol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。
样品测定的前处理
1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），
浸泡 2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻 30min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理）
2、按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入
1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在 EP管中加入下列试剂）
|
试剂名称（μL） |
加样孔 |
|||
|
测定管 |
对照管 |
标准管 |
空白管 |
|
|
样本 |
100 |
100 |
|
|
|
0.1μmol/mL 标准液 |
|
|
100 |
|
|
蒸馏水 |
|
500 |
|
600 |
|
试剂一 |
375 |
|
375 |
|
|
试剂二 |
125 |
|
125 |
|
|
混匀后，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 30min |
||||
|
试剂三 |
250 |
250 |
250 |
250 |
|
试剂四 |
250 |
250 |
250 |
250 |
混匀，显色 20min， 540nm 下比色
注意：标准管和空白管只需测一次，每个测定管设一个对照管。