点击图片查看原图
微量法
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
GLS（EC 3.5.1.2） 存在于高等动物和某些细菌以及植物根中，催化谷氨酰胺水解成谷氨酸和氨，在氮素代谢中具有重要调控作用，尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。
测定原理：
GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。
需自备仪器和用品：
台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵、冰和双蒸水。
试剂组成和配制：
试剂一×2 瓶，60 mL，4 ℃保存；
试剂二×1 瓶，40 mL，4 ℃保存；
试剂三×1 瓶，60 mL，常温保存；
试剂四×1 瓶，5 mL，常温保存；
试剂五×1 瓶，3 mL，常温保存；
试剂六×1瓶，3 mL，常温避光保存。
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零。
2、样品测定（在EP管中加入下列试剂）：
|
试剂名称（uL） |
测定管 |
对照管 |
|
样本 |
25 |
|
|
蒸馏水 |
|
25 |
|
试剂一 |
100 |
100 |
|
试剂二 |
400 |
400 |
|
混匀，37℃水浴 1 小时 |
||
|
试剂三 |
525 |
525 |
|
混匀，8000 g，25℃离心 10 min；取上清液，在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂 |
||
|
上清液 |
130 |
130 |
|
试剂四 |
30 |
30 |
|
试剂五 |
20 |
20 |
|
试剂六 |
20 |
20 |
混匀，420nm 处读取测定管和对照管吸光值，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。对照管只要做
一管。