微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
APX是植物清除活性氧的重要酶之一,也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX具有多种同功酶,分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体,以及过氧化体和类囊体膜上。APX催化 H2O2氧化AsA,是植AsA的主要消耗者。APX的活性直接影响到AsA的含量,APX与 AsA具有一定的负相关性。
测定原理:
APX 催化H2O2氧化AsA,通过测定AsA氧化速率,来计算得APX活性。
自备仪器用品:
低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV 板)、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加3mL蒸馏水充分溶解。
试剂三:液体×1 支,4℃保存。
粗酶液提取:
按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)进行冰浴匀浆。13000g,4℃离心20min,取上清置冰上待测。
测定:
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长到290nm,用蒸馏水调零。
2. 试剂一在25℃中预热30min。
3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、140μL预热的试剂一20μL试剂二和20μL试剂三,迅速混匀后在290nm测定10s和130s光吸收A1和A2,△A=A1-A2。