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微量法
注意：正式实验之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。
测定原理：
羰基与2,4-二硝基苯肼反应生成红色2,4-二硝基苯腙，在370nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器：
天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯。
试剂组成和配制：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂 0.1g×5 支，4℃避光保存。（使用前根据样品数，每支加1mL水溶解，每支为10个样品用量）
试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。
试剂四：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。
试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。
试剂六：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。
样品处理：
1. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，于4℃，4000g 离心10min，取上清，加入0.1mL试剂一，室温放置 10min，4℃，10000g 离心10min，取上清待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体样本：直接测定。
测定步骤和操作表：
1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至370nm。
2、操作表
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对照管 |
测定管 |
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样品（μL） |
60 |
60 |
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试剂二（μL） |
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120 |
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试剂三（μL） |
120 |
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混匀，37℃避光反应 1h |
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试剂四（μL） |
150 |
150 |
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静置 5min，4℃，12000rpm 离心 15min，弃上清，留沉淀 |
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试剂五（μL） |
300 |
300 |
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漩涡混匀，4℃，12000rpm 离心 10min，弃上清，留沉淀 |
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试剂五（μL） |
300 |
300 |
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漩涡混匀，4℃，12000rpm 离心 10min，弃上清，留沉淀 |
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试剂五（μL） |
300 |
300 |
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漩涡混匀，4℃，12000rpm 离心 10min，弃上清，留沉淀 |
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试剂六（μL） |
300 |
300 |
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漩涡混匀，37℃温育 15min，沉淀全部溶解后，4℃，12000rpm 离心 15min，取上清 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中，试剂六调零，测定 A 370 。ΔA=A 测定管-A 对照管 |
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