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可见分光光度法
注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。
测定原理
超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成 NO2－ ，NO2－在对氨基苯磺酸和 α－萘胺的作用下，生成红色的偶氮化合物，在 530nm 处有特征吸收峰，根据 A 530值可以计算样品中 O2－含量，反应式为 NH2OH + 2O2－＋H＋→ NO2－＋H2O2＋H2O。
自备实验用品及仪器
天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、氯仿和蒸馏水。
试剂组成和配制
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂四： 氯仿，自备。
超氧阴离子提取
1. 植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建
议500万细胞加入 1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声3秒，间隔7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。
3. 血清或培养液：直接测定。
测定操作表
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空白管 |
测定管 |
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样本（μL） |
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200 |
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提取液（μL） |
500 |
300 |
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试剂一（μL） |
400 |
400 |
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混匀，37℃水浴 20min |
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试剂二（μL） |
300 |
300 |
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试剂三（μL） |
300 |
300 |
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混匀，37℃水浴 20min |
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试剂四（μL） |
500 |
500 |
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混匀，8000rpm，25℃，离心 5min，小心吸取上层水相 1mL， 1mL 玻璃比色皿，空白管调 零，测定 A 530 。 |
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