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可见分光光度法
注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
生物体内巯基主要包括非蛋白质巯基和蛋白质巯基。巯基化合物在体内具有重要的功能，对生物体的自我调节具有非常重要的生理意义。
测定原理
巯基基团与5,5’-二硫代-双-硝基苯甲酸（DTNB）反应，生成黄色化合物，在412nm处有吸收峰。
自备实验用品
天平、研钵、可见分光光度计、恒温水浴锅、1mL玻璃比色皿和蒸馏水，甲醇。
试剂组成和配制
提取液：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 40 mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 3 mL×1 瓶，4℃避光保存。
样品的制备
1. 动物、植物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后加入4mL甲醇，室温震荡10min，然后 10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）然后10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
3. 血清、培养液：取0.1mL，加0.4mL甲醇，室温震荡10min，然后10000g，4℃离心10min，
取上清置冰上待测。
操作步骤
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对照管 |
测定管 |
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样品（μL） |
200 |
200 |
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试剂一（μL） |
750 |
750 |
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试剂二（μL） |
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50 |
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H2O（μL） |
50 |
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混匀，25℃静置10min，1cm光径玻璃比色皿，双蒸水调零，测定412nm吸光值， ΔA=A测定-A对照。 |
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计算公式
标准曲线：y = 1.7236 x，R2 = 0.9994
1. 组织：
非蛋白质巯基含量（μmol/g）=ΔA÷1.7236×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×5
=14.5×ΔA÷W
2. 血清、培养液：
非蛋白质巯基巯基含量（μmol/L）=ΔA÷1.7236×V 反总÷V 样×5×103
=14500×ΔA
3. 细胞：
非蛋白质巯基含量（μmol/104）=ΔA÷1.7236×V 反总÷(V 样÷V样总×细胞数量)×5
=14.5×ΔA÷细胞数量
V 反总：反应总体积，1mL；V 样：反应中样品体积，0.2mL；V 样总：加入提取液体积1mL； W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；103：1mmol/ L=103μmol/ L
注意事项
检出限为10μmol/L。