点击图片查看原图
可见分光光度法
注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
生物体的脱氢酶(Plant dehydrogenase , DHA)的活性在很大程度上反映了生物体的活性状态，能直接表示生物细胞对其基质降解能力的强弱。
测定原理
受氢体 2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride，即 TTC）在细胞呼吸过程中接受氢以后，其还原产物三苯基甲鐟（Triphenyl Formazone，即 TF）呈现红色，在波长 485nm 处有吸收峰，测定其 485nm 吸光值，即得植物脱氢酶活性。
需自备实验仪器及用品
恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、研钵、滤纸、可见分光光度计、1mL 比色皿、冰、蒸馏水和乙酸乙酯（不允许快递，请用户自备）。
试剂的组成和配制
试剂一：粉剂×2瓶，使用前加少量水溶解，定容至60mL，避光、4℃保存（尽量现配现用）。
试剂二：液体 60mL×6，4℃保存。
试剂三：乙酸乙酯，自备。
样品处理
称取 0.5-1g 的植物组织，用双蒸水清洗 3-4 次，用滤纸吸干水分，备用。
测定步骤和操作表
|
|
对照管 |
测定管 |
|
样品（g） |
0.5-1 |
0.5-1 |
|
试剂一（mL） |
|
5 |
|
试剂二（mL） |
10 |
5 |
|
充分混匀，37℃，暗培养3h，取出后立即冰浴5min，过滤，去滤液，尽量用滤纸吸干样品， 置于研钵中。 |
||
|
试剂三（mL） |
5 |
5 |
|
充分研磨，吸取红色液体于离心管中，用少量试剂三冲洗研钵，一起加入离心管，用试剂三 定容至15mL，10000rpm/min，4℃，离心5min，取上清，于1cm光径，蒸馏水调零，测定OD485 。 |
||
脱氢酶活力计算
酶活单位定义：在 37℃时，每小时每克样品使反应体系 OD 值每增加 0.01 为一个酶活单位。
计算公式：脱氢酶活性（U/g·h）=（OD485测定-OD485对照）÷0.01 ÷样品质量(g) ÷反应时间（h）
注意事项
1. 配制好的试剂一避光保存于 4℃，尽量在一周内使用，若出现红色，则不能使用。
2. 试剂三易挥发，有毒，为了您的健康，请穿实验服，戴口罩，戴乳胶手套操作。
3. 反应完成后立即冰浴以终止反应，并去除干净残留的反应液。
4. 如果测定出来的吸光值较大，需把样品适当稀释再进行测定。
5. 试剂盒 2-8℃保存。