可见分光光度法

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定， 确保蛋白浓度在 20-2000μg/ml 内。

测定意义

样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。

测定原理

碱性条件下，蛋白质中半胱氨酸、胱氨酸、色氨酸、酪氨酸以及肽键，能将 Cu2+还原成 Cu+； 2 分子的 BCA 与 Cu+结合，生成紫色络合物，在 40-595nm 有吸收峰，562nm 处吸收峰强。

自备仪器和用品

台式离心机、恒温水浴锅、可见分光光度计、移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂 A：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。试剂 B：液体 1mL×1 支，4℃保存。标准蛋白：液体×1 支，4℃保存。

工作液配制：临用前请根据拟用工作液体积（样本数×1mL），将试剂 A 和 B 按照 50：1 的比例混合，盖紧后充分混匀。

样品中可溶性蛋白质提取

1. 液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。

2. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）

3. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作

1. 分光光度计预热 30min，调节波长到 562nm，蒸馏水调零。

2. 工作液置于 60℃水浴预热 30min。