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可见分光光度法
注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义
维生素B1（Vitamin B1）是构成脱羧辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素，在生物体能量代谢中有重要的作用。
测定原理
VB1在碱性条件下还原铁生成亚铁，亚铁与Fe3+在弱酸条件下生成普鲁士蓝，在704nm有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、离心机、可见分光光度计、恒温水浴锅、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。
试剂组成和配制
提取液：液体 35mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 1mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。
试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。
试剂五：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
样本处理
1. 组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入0.6mL提取液）加入提取液，60℃浸提30min，加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，13000g 离心10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心 20-30分钟）。
2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.6mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；加蒸馏水0.4mL，混匀后于25℃，13000g 离心10min，取上清测定。
3. 血清：直接测定。
测定操作
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空白管 |
测定管 |
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样品（μL） |
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0.1 |
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试剂一（μL） |
100 |
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试剂二（μL） |
80 |
80 |
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试剂三（μL） |
100 |
100 |
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充分混匀，80℃反应 10min |
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提取液（μL） |
80 |
80 |
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试剂四（μL） |
220 |
220 |
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试剂五（μL） |
120 |
120 |
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H2O（μL） |
300 |
300 |
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充分混匀，静置20min，于1mL玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定704nm处吸光值，记为A空白管和A测定管，△A=A测定管-A空白管。 |
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